Herausforderungen bei der Verwendung von Plasmid-DNA für Biopharma und Gentherapie
Einführung
Die Nachfrage nach hochwertiger und hochreiner Plasmid-DNA ist angesichts der rasanten Fortschritte bei ihrer Verwendung stark gestiegen. Neue Anwendungen wie die mRNA-basierte Impfstoffentwicklung, die Antikörperproduktion und die Gentherapie mit viralen Vektoren erfordern Plasmid-DNA als wichtiges Ausgangsmaterial. Ein besonders schwieriger Aspekt dieser Verfahren ist das Vorhandensein von Endotoxinen, die bekanntermaßen häufige Verunreinigungen der aus Bakterien extrahierten Plasmid-DNA darstellen. Während viele typische nachgeschaltete Anwendungen, wie Sequenzierung und Klonierung, durch das Vorhandensein dieser Moleküle nicht beeinträchtigt werden, sind Endotoxine bei biopharmazeutischen und gentherapeutischen Anwendungen von großer Bedeutung.
Was sind die biologischen Auswirkungen von Endotoxinen?
Endotoxine sind Lipopolysaccharide, die sich in der äußeren Membran von gramnegativen Bakterien befinden. In vivo binden Endotoxine an Rezeptoren auf der Oberfläche von Immunzellen und stimulieren diese zur Ausschüttung entzündungsfördernder Zytokine (z. B. Tumornekrosefaktoren und plättchenaktivierende Faktoren) und induzieren die Produktion von Entzündungsmediatoren wie Interleukin (IL)-1 und IL-6. Wenn der Endotoxingehalt die Fähigkeiten des Immunsystems übersteigt, kann es überreagieren und eine überschießende Immunreaktion auslösen, die mit hohem Fieber und im schlimmsten Fall mit septischem Schock und Tod durch Organversagen einhergeht. Geringere Endotoxinspiegel verursachen ebenfalls zahlreiche biologische Wirkungen, darunter Fieber, eine veränderte Resistenz gegen bakterielle Infektionen und Leukopenie mit anschließender Leukozytose.
Die Intensität dieser Immunreaktion verdeutlicht den Bedarf an endotoxinfreier Plasmid-DNA für gentherapeutische Ansätze. Die Gentherapie ist jedoch nicht die einzige nachgeschaltete Anwendung, die durch das Vorhandensein von Endotoxinen in Plasmid-DNA beeinträchtigt wird. Es wurde auch beschrieben, dass Endotoxine verschiedene Auswirkungen auf Zellkulturen haben, einschließlich erhöhter Zytotoxizität und verändertem Zellwachstum, Differenzierung und Proteinproduktion. Empfindliche Zellen reagieren selbst auf sehr niedrige Endotoxinkonzentrationen in der Plasmid-DNA stark, was zu einer deutlich verringerten Transfektionseffizienz oder falschen Ergebnissen bei Genexpressionsanalysen führt. Im Allgemeinen erweist sich das Vorhandensein von Endotoxinen in Plasmid-DNA als eine nicht kontrollierbare Variable, so dass eine zuverlässige Interpretation der Daten und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse ihre Entfernung erfordern.
Wie wählt man das richtige Produkt zur Entfernung von Endotoxinen aus?
Der Grad der Endotoxin-Kontamination von Plasmid-DNA hängt stark von der verwendeten Reinigungsmethode ab. Obwohl es wahrscheinlich keine völlige Abwesenheit von Endotoxinen gibt, besteht allgemeines Einvernehmen darüber, dass gereinigte DNA (mit Werten von weniger als 0,1EU/μg DNA) als endotoxinfrei (EF) anzusehen ist. Die hochmoderne Technologie, die verwendet wird, um solch hohe Reinheiten innerhalb eines bequemen Plasmidreinigungssystems (ausgehend von Bakterienzellen) zu erreichen, basiert auf Anionenaustauschchromatographie und erfordert spezielle patentierte Puffersysteme.
Warum Macherey-Nagel™ für diese Plasmid-DNA-Anwendungen wählen?
Seit der Entwicklung der Kit-basierten Plasmidisolierung vor mehr als 35 Jahren ist Macherey-Nagel™ ein Pionier für schnelle und äußerst zuverlässige Lösungen für die Aufreinigung von Plasmid-DNA. Die Macherey-Nagel™ NucleoBond™ Xtra EF Kits kombinieren eine exzellente Anionenaustausch-Chromatographie-Methode mit einem schnellen und effizienten Puffersystem zur Endotoxin-Entfernung. Sie nutzen eine proprietäre Technologie, die Endotoxine maskiert und verhindert, dass sie sich an die Anionenaustauschermatrix binden. Dieses Verfahren ist hochwirksam und bequem, da die Additive in gebrauchsfertigen Puffern bereitgestellt werden und zusätzliche Inkubationsschritte vermieden werden. Mit diesen NucleoBond™ EF-Kits lassen sich Endotoxinkonzentrationen von nur 0,01-0,1EU/μg DNA erzielen, also weit unterhalb des EF-Schwellenwerts. Die resultierende EF-Plasmid-DNA ist selbst für anspruchsvolle Anwendungen geeignet und bietet die höchstmögliche Reinheit.
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